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壳寡糖抗肿瘤作用及免疫调节机理的研究*

时间:2017-10-12 02:00:11来源:www.xielunwen.net 作者:admin 点击: 28 次
作者:吴海明,华晓阳,何登全 【摘要】目的研究壳寡糖对小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用以及壳寡糖对培养的巨噬细胞相关的细胞因子表达的影响。方法接种肿瘤的小鼠尾静脉注射壳寡糖,观察壳寡糖对肿瘤的生长和抑制作用。用相对定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子转录和翻译水平的影响。结果壳寡糖对S18

       作者:吴海明,华晓阳,何登全

【摘要】  目的  研究壳寡糖对小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用以及壳寡糖对培养的巨噬细胞相关的细胞因子表达的影响。方法  接种肿瘤的小鼠尾静脉注射壳寡糖,观察壳寡糖对肿瘤的生长和抑制作用。用相对定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子转录和翻译水平的影响。结果  壳寡糖对S180肉瘤的抑瘤率为35.02%(P<0.001),对Lewis肺癌的转移灶的影响:实验组(2.1±1.73),对照组(4.0±2.14),两组比较,P<0.05。巨噬细胞加入壳寡糖作用24h后,细胞因子的表达明显增强(P<0.01)。结论  壳寡糖具有良好抑制肿瘤生长和转移的作用。壳寡糖可增强巨噬细胞相关的细胞因子表达。
   
    【关键词】  壳寡糖;肿瘤;巨噬细胞;细胞因子
        
    【Abstract】  Objective  To study the influence of oligochitosan in inhibiting growth and metastasis  of  tumor in  rats, and in expression of cytokines associated with macrophage. Methods  Inhibition of growth of tumor was  observed after oligochitosan injected into rats through tail vein,the influence in transcription and translation of cytokines associated with macrophage was measured by RT-PCR and ELISA techniques.Results  Inhibition rate of  sarcoma S180 was  35.02%(P<0.001) after injection of oligochitosan. The  influence in  metastasis of Lewis lung cancer(P<0.05):experiment group(2.1±1.73),controlled group(4.0±2.14). 24hs  after oligochitosan added to macrophage,expression of cytokine increased significantly(P<0.01). Conclusion  Oligochitosan can inhibit growth  and  metastasis of tumor,and enhance expression of cytokines associated with macrophage.
   
    【Key words】  oligochitosan; tumor;macrophage;cytokine
   
    甲壳素是自然界丰富的生物资源之一,其部分脱乙酰化产物壳聚糖,具有抗肿瘤、免疫调节、抑菌等多种生理功能。但壳聚糖不溶于水,利用纤维素酶将其降解为壳寡糖,具有较好的水溶性易被人体吸收,本实验旨在研究壳寡糖对实验性小鼠S180肿瘤和Lewis肺癌的抑制作用以及壳寡糖对体外培养的巨噬细胞相关的细胞因子基因表达的影响。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  材料
   
    1.1.1  壳寡糖  由浙大医学院分子生物学实验室制备。
   
    1.1.2  动物来源  小鼠由浙江大学医学院动物中心提供,体重为18~20g。
   
    1.1.3  小鼠单核巨噬细胞RAW264.7  由中科院上海细胞所提供。
   
    1.1.4  标准DNA marker和ELISA实验试剂  由上海贝西科技公司提供。
   
    1.2  方法
   
    1.2.1  壳寡糖抗肿瘤作用实验方法  无菌取S180肉瘤和Lewis肺癌细胞,制成2×107细胞/ml的细胞悬液;皮下注射肿瘤液于ICR种小鼠(0.2ml/只),次日分组进行实验,每组10只ICR种小鼠。实验组尾静脉注射100mg/kg的壳寡糖,对照组注射生理盐水,停药次日处死小鼠,剥离实体瘤称重或观察转移病灶数,计算抑瘤率(%)。
   
    1.2.2  壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子表达的影响实验方法  培养小鼠采用RT-PCR法和ELISA法研究壳寡糖对巨噬细胞IL-1、TNF-a和IL-18的基因表达的影响:实验组和对照组巨噬细胞→分别提取RNA和收集上清液→RT-PCR法检测mRNA水平基因表达的变化以及ELISA法检测蛋白表达量的变化。
   
    1.3  统计学方法  各组值均采用均数±标准差(x±s)表示,组间采用t检验,P<0.05为统计学差异有显著性意义。
   
    2  结果
   
    2.1  壳寡糖抗肿瘤作用  壳寡糖对小鼠S180肉瘤生长的影响(见表1),从表中可以看出实验组的抑瘤率为35.02%(P<0.001),环磷酰胺组的抑瘤率为50.16%(P<0.001)。壳寡糖对Lewis肺癌的影响(见表2)实验组的转移灶为(2.1±1.73),对照组的转移灶为(4.0±2.14),P<0.05。综合表1和表2可以看出壳寡糖对肿瘤的生长和转移具有明显的抑制作用。

表1  壳寡糖对小鼠S180肉瘤生长的影响 

表2  壳寡糖对小鼠Lewis肺癌转移的影响 

    2.2  壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子表达的影响
   
    2.2.1  壳寡糖最适作用时间的确定  巨噬细胞贴壁后加入壳寡糖,在4、8、16、24、48h不同时间段通过RT-PCR法检测IL-1β、INF-α、IL-18的基因转录水平,结果显示24h达到高峰,故确定以24h为壳寡糖最适作用时间。
   
    2.2.2  壳寡糖最适作用浓度的确定  小鼠巨噬细胞经培养贴壁后,按浓度10、20、30、40、60、80μg/ml的剂量加入壳寡糖继续培养,各组巨噬细胞样本经RT-PCR法结果见表3、4、5。

表3  不同浓度壳寡糖对巨噬细胞IL-1β基因转录水平的影响


注:以β-actin为内参照标准,各组均值以均数±标准差表示;*表示经t检验与对照组差异有显著性,P<0.05(n=4)

表4  不同浓度壳寡糖对巨噬细胞IL-18基因转录水平的影响 

注:以β-actin为内参照标准,各组均值以均数±标准差表示;◆表示经t检验与对照组差异有显著性,P<0.05,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P<0.01(n=4)

表5  不同浓度壳寡糖对巨噬细胞TNF-α基因转录水平的影响 

注:以β-actin为内参照标准,各组均值以均数±标准差表示;*表示经t检验与对照组差异有显著性,P<0.05(n=4) 

    结果显示10μg/ml的壳寡糖实验组与对照组比较无显著性差异,20、30及40μg/ml组均差异有显著性,故确定20μg/ml的壳寡糖为对IL-1β和TNF-α的最适作用浓度,以40μg/ml的壳寡糖作为对IL-18的最适作用浓度。

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