江山论文代写网

当前位置: 首页 > 临床医学 > 健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖诱导的肝损伤大鼠库普弗细胞活化信号通路的干预

健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖诱导的肝损伤大鼠库普弗细胞活化信号通路的干预

时间:2017-10-05 09:00:10来源:www.xielunwen.net 作者:admin 点击: 38 次
作者:彭景华,方志红,崔剑巍,冯琴,许丽莉,顾宏图,胡义扬 【摘要】观察健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的肝损伤大鼠库普弗细胞活化信号通路的影响。方法:采用Lieber-Decarli酒精饮料饲养6周诱导的酒精性肝损伤模型,分设正常组,无酒精饮料组,酒精饮料组和酒精饮料加健脾活血方组,造模第3周起灌胃给药或蒸馏水至第6周末,各

                作者:彭景华,方志红,崔剑巍,冯琴,许丽莉,顾宏图,胡义扬

【摘要】  观察健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的肝损伤大鼠库普弗细胞活化信号通路的影响。方法:采用Lieber-Decarli酒精饮料饲养6周诱导的酒精性肝损伤模型,分设正常组,无酒精饮料组,酒精饮料组和酒精饮料加健脾活血方组,造模第3周起灌胃给药或蒸馏水至第6周末,各组再以LPS 10 mg/kg 一次性灌胃,3.5 h后取材。检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)活性和肝组织甘油三酯(triglyceride, TG)含量;HE染色观察大鼠肝组织病理改变;CD68免疫组化观察库普弗细胞活化状态;ELISA法检测门脉血浆肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)含量;Western-blotting方法检测肝组织TNF-α、磷酸化的IκB(phosphorylation-IκB, P-IκB)、Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)、CD68蛋白表达。结果:经健脾活血方干预后,大鼠肝脏组织病理损伤减轻,肝组织TG含量以及血清ALT活性和门脉血浆TNF-α含量下降;同时,大鼠肝脏TNF-α、P-IκB、TLR4和CD68蛋白表达明显减轻。结论:健脾活血方对酒精复合LPS诱导的肝损伤大鼠CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α具明显抑制作用。
  

【关键词】  肝疾病, 酒精性

 酒精性肝病长期以来是西方国家的主要肝脏疾病之一,而近年来的流行病学调查资料显示,其发病率在我国也呈现逐年上升的趋势[1]。目前,围绕“二次攻击”学说, 内毒素或脂多糖(lipopolysaccharides, LPS) 激活肝脏库普弗细胞产生炎症细胞因子是酒精性肝损伤研究的热点之一。现已知,LPS经内毒素受体如CD14、Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)的作用激活肝脏库普弗细胞,活化核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信号启动炎症因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的转录,导致肝损伤。我们前期的研究结果已经证实,中药复方健脾活血方具有抗Lieber-Decarli酒精饮料诱导的大鼠酒精性肝损伤的作用,并且进一步证实该方能够通过抑制酒精引起的肠渗漏[2]及脂质过氧化[3]来达到上述的药理作用。为了进一步探讨健脾活血方抗酒精性肝损伤的作用机制,本文观察了该方对于Lieber-Decarli酒精饮料复合LPS灌胃二次攻击诱导的大鼠肝损伤模型中LPS激活肝脏库普弗细胞信号通路的影响,现报道如下。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 动物和药物 SD雄性大鼠42只,体质量150~160 g,购自中国科学院上海实验动物中心。健脾活血方由白术、白芍、丹参、泽泻、五味子、姜黄、枳壳和葛根等组成。先提取药物(白术和枳壳等)中的挥发性成分,然后再将药物水提,最后将挥发油成分混合入水提物中。动物用药生药含量为 0.9 g/ml 。

  1.1.2 主要试剂 Lieber-Decarli酒精饲料:无水乙醇,购自上海振兴化工一厂产品,分析纯AR,批号200402359;干酪素,L-胱氨酸,DL-甲硫氨酸,玉米油,橄榄油,红花油,麦芽糖糊精,纤维素,水溶性膳食纤维,酒石酸氢胆碱,黄原胶,磷酸氢钙,氯化钠,柠檬酸钾,硫酸钾,氧化镁,硫酸锰,硫酸亚铁,碳酸锌,碳酸铜,碘酸钾,亚硒酸钠,硫酸铬钾,氟化钠,蔗糖,盐酸维生素B1,核黄素,盐酸维生素B6,烟酸,泛酸钙,叶酸,维生素H,维生素B12, 乙酸维生素A, 维生素D3,乙酸维生素E,甲基萘醌亚硫酸氢钠,对 氨基苯甲酸,肌醇,右旋糖,中国医药(集团)上海化学试剂公司产品。LPS(Escherichia coli 0111:B4),为美国Sigma公司产品,实验时用灭菌注射用水溶解,工作终浓度1 mg/ml。检测试剂:丙氨酸氨基转移酶(alanine amin-otransferase, ALT)测定试剂盒,为卫生部上海生物制品研究所产品;甘油三酯(triglyceride, TG)测定试剂盒,为浙江东瓯生物工程有限公司产品。大鼠血浆TNF-α检测试剂盒,为R&D公司产品;DAB浓缩显色液和小牛血清白蛋白,均为上海华美生物工程公司产品;胃蛋白酶和多聚赖氨酸,均为北京鼎国生物技术公司产品;二甲苯和苏木素染料,均为上海化学试剂厂产品;中性树胶,为上海标本模型厂产品;30%过氧化氢,为上海桃浦化工厂产品;苯甲基磺酰氟,为Serva公司产品;三氨基甲烷,为上海生物工程公司产品;β巯基乙醇、吐温20、十二烷基硫酸钠、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、甘氨酸和40%Acr/Bis溶液,均为Bio-Rad公司产品;甲醇,为Burdick & Jackson公司产品;硝酸纤维素膜和溴酚蓝,均为Amersham公司产品。Nonidet P40和蛋白酶抑制剂,均为Roche公司产品;化学发光底物,为Pierce公司产品;脱脂奶粉,为Nestle公司产品;医用X光胶片(12.7 cm×18.7 cm),为上海海鸥照相机有限公司感光材料厂产品;多克隆羊抗大鼠TNF-α抗体,为R&D公司产品。单克隆小鼠抗大鼠磷酸化IκB抗体(phosphorylation-IκB, P-IκB),为Cell Signaling Technology公司产品;多克隆羊抗大鼠TLR4抗体,为Santa Cruz Biotechnology公司产品;单克隆小鼠抗大鼠CD68抗体,为Serotec公司产品;多克隆兔抗羊Ⅱ抗,为Jackson Immu-noresearch Laboratories Inc公司产品;单克隆兔抗小鼠Ⅱ抗,为Santa Cruz Biotechnology公司产品。

  1.2 实验方法

  1.2.1 造模与分组 参照Lieber-DeCarli酒精饲料配方和美国杰弗逊大学医学院酒精性肝病研究中心相关饲养方案,42只大鼠随机分正常对照组( 6只 );酒精液体饲料组(24只)和无酒精液体饲料组(简称对照组,12只),均单居。除正常组外,分别采用特制负压式带刻度玻璃容器,每日消毒后定量饲以酒精热量占36%的Lieber-DeCarli酒精饲料和含相同热量的无酒精对照饲料。第3周起,酒精液体饲料组再次随机分为酒精液体饲料组(简称模型组,12只)、酒精液体饲料加健脾活血方组(简称中药组,12只)。中药组在给予酒精饲料的同时,灌胃给药0.01 ml/g,1次/d,正常组、模型组和对照组按相同标准给予蒸馏水。

  1.2.2 取材 造模6周后,大鼠禁食5 h,分别灌服LPS 10 mg/kg(间隔10 min灌1只),并在灌服LPS 3.5 h后,分别采取门静脉血(无热源肝素抗凝管收集制备血浆)、下腔静脉血和肝组织。

  1.2.3 观察项目和方法 (1)大鼠一般状态、进食量及体质量变化。(2)肝组织病理变化:HE染色,光镜下观察肝组织炎症变化和脂肪变性程度。 (3)血 清ALT活性和肝组织TG含量:采用生化试剂盒检测。(4)门脉血浆TNF-α含量测定:采用ELISA试剂盒测定。(5)肝组织CD68蛋白表达及分布:免疫组化染色法。Ⅰ抗,PBS稀释,工作浓度1∶100;Ⅱ抗,PBS稀释,工作浓度1∶250。(6)肝组织CD68、TLR4和TNF-α蛋白表达:Western-blotting法。

  1.3 统计学方法 使用SPSS 11.0软件包进行统计学分析,计量资料用 x ± s 表示,组间两两比较用 t 检验。

  2 结果

  2.1 一般状态、进食量及体质量变化 对照组1只大鼠在灌饲LPS时意外死亡。各组大鼠进食量和热卡摄入无明显差异,排除饮食及酒精量的差异对实验结果的影响。造模前后同期各组大鼠体质量无 明显差异。

  2.2 肝脏病理变化 模型组大鼠视野内1/3以上的肝细胞出现脂肪变性,以肝腺泡3带为中心,其余的大部分肝细胞变性、肿胀,胞浆内充满小的空泡,即以酒精性脂肪肝病理表现为主。中药组大鼠肝细胞脂肪变性程度明显减轻,脂滴数量减少。此外,对照组大鼠有3只也偶见有散在小泡状脂肪滴。见图1。

  2.3 肝脏TG含量变化 模型组肝TG含量为正常组的9.4倍和对照组的4.9倍。健脾活血方可以明显降低肝组织TG含量,中药组TG含量均值为模型组的67%。见表1。

  2.4 门静脉血浆TNF-α含量和血清ALT活性的变化 模型组门静脉血浆TNF-α含量和血清ALT活性明显高于正常组和对照组。而中药组的上述指标均明显低于模型组。见表1。

  2.5 肝脏库普弗细胞活化状态 CD68免疫组化染色显示,正常组和对照组大鼠肝脏肝小叶汇管区肝窦内可见极少量CD68阳性染色。模型组大鼠肝脏可见明显的CD68阳性染色区域,集中在肝细胞脂肪变性及炎细胞浸润明显的汇管区肝窦内。中药组大鼠CD68阳性染色较模型组明显减少,但分布同模型组。见图1。

  2.6 肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表达的变化 正常组大鼠肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白均有少量表达,对照组TNF-α蛋白表达也略有增加,模型组大鼠肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表达则均明显增加,而中药组的上述蛋白表达均明显低于酒精模型组。见图2。

  图1 各组大鼠肝组织HE染色和CD68免疫组化染色(×200) (略)

  Figure 1 HE staining for liver tissue and immunohistochemical staining for CD68 (×200)

  A: HE staining for liver tissue; A1: Normal group; A2: Control liquid diet group; A3: Ethanol liquid diet group; A4: Jianpi Huoxue Decoction group. B: Immunohistochemical staining for CD68; B1: Normal group; B2: Control liquid diet group; B3: Ethanol liquid diet group; B4: Jianpi Huoxue Decoction group.

(责任编辑:admin)
------分隔线----------------------------