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NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影响

时间:2017-10-05 09:00:03来源:www.xielunwen.net 作者:admin 点击: 71 次
【摘要】研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA,HMG-CoA)还原酶抑制剂匹伐他汀(pitavastatin,NK-104)对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影响。方法:采用细胞培养技术,以肝癌细胞系HepG2为靶细胞,以不同浓度的药物处理细胞48h后,利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;利用荧光染料Hoechst

【摘要】  研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA, HMG-CoA)还原酶抑制剂匹伐他汀(pitavastatin, NK-104)对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影响。方法:采用细胞培养技术,以肝癌细胞系HepG 2为靶细胞,以不同浓度的药物处理细胞48 h后,利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;利用荧光染料Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察细胞核碎片;以流式细胞仪分析细胞周期的变化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法检测caspase-3活性。结果:NK-104(10 μmol/L)对HepG 2细胞有明显抑制作用,可诱导HepG 2细胞凋亡,并能增强caspase-3基因的活性。结论:NK-104能够诱导HepG 2细胞凋亡,其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。

【关键词】  肝癌

 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA, HMG-CoA)还原酶抑制剂,统称为抑制素,是重要的脂类合成抑制剂,主要在人体肝脏中代谢,临床上广泛应用于治疗高脂血症[1]。 最近研究发现,HMG-CoA还原酶抑制剂具有生物学多效性,与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用[2]、体内与5氟尿嘧啶(fluorouracil, 5-Fu)共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期[3]。匹伐他汀(pitavastatin, NK-104)是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA还原酶抑制剂[4]。在血管内皮细胞系NK-104通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K-Akt)基因激活途径对内皮细胞的保护作用已有报道[5],但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞系HepG 2通过2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二硫代苯)-2H-四氮唑单钠盐 {[2-(2-methoxy-4-nitrophe-nyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt], WST-8}、荧光染料Hoechst33258染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶3比色法等检测方法,研究NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影响,为NK-104在抗肿瘤中的作用机制提供实验依据。

  1 材料和方法

  1.1 主要材料与仪器 NK-104,日本兴和有限公司(日本名古屋)和日产化学工业公司(日本东京)产品;荧光染料Hoechst 33258、甲羟戊酸( mevalonic acid, MEV)和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液(PI 100 g/L, 1% Triton 100, 9 g/L NaCl),Sigma公司产品。流式细胞仪,2000 FCA,美国BD公司产品。

  1.2 实验方法

  1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG 2(美国ATCC公司产品)在含10%胎牛血清的DMEM培养基、5% CO2、37 ℃条件下培养。实验中,细胞种植于适当培养皿中,90%的细胞融合时,用磷酸盐缓冲液洗净后,加入适量含有NK-104和MEV( 1 mmol/L )等药物的培养液,37 ℃培养箱中培养。

  1.2.2 WST-8方法 利用WST-8试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG 2细胞(1×104个细胞/孔)接种于含100 μl培养液的96孔培养板中,NK-104( 0.1 ~100 μmol/L)治疗48 h后,分别加入WST-8试剂10 μl(日本同仁化学研究所)培养2 h后,选择450 nm波长,测定各孔的吸光度OD值。

  1.2.3 Hoechst 33258染色 细胞经药物刺激 48 h 后,甲醇-冰乙酸(3∶1)细胞固定液4 ℃固定5 min,磷酸盐缓冲液稍洗后,点加Hoechst 33258染色液, 10 min 。用滤纸沾去多余液体,封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。

  1.2.4 流式细胞仪检测凋亡峰 在室温下将刺激48 h后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次,并在适当的染色缓冲液中吸取100 μl的细胞(1×105)至试 管中。加入200 μl RNase A,37 ℃水浴30 min,再加800 μl PI染色液混匀,4 ℃避光30 min后,立即上机分析。

  1.2.5 半胱氨酸蛋白酶3比色法 经药物治疗 48 h 后收集细胞,采用半胱氨酸蛋白酶3比色法试剂盒按照厂家说明进行测定(Medical & Biological Laboratories Co., LTD, Japan)。

  1.3 统计学方法 数据均以 x ± s 表示,采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析,采用 t 检验。

  2 结果

  2.1 NK-104对HepG 2细胞增殖的抑制作用 为了确定NK-104在人肝癌细胞HepG 2中的治疗浓度,采用WST-8方法对细胞的增殖作用进行测定。与对照组相比,NK-104在10和100 μmol/L时,对HepG 2细胞生长均有明显的抑制作用。 100 μmol/L 时,近50%的细胞死亡( P <0.01)。见图1。

  图1 不同浓度NK-104对HepG 2生长的抑制作用(略)

  Figure 1 Growth inhibition of HepG 2 cells by NK-104

  **P <0.01, vs control group.

  2.2 NK-104诱导细胞凋亡的形态变化 对照组细胞界限清晰,胞浆丰富,细胞核呈弥散、均匀荧光分布,经10~100 μmol/L NK-104处理后,HepG 2发生细胞凋亡,细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒及明显核形态变化。见图2。

  2.3 NK-104对HepG 2细胞周期的影响 与对照组相比,NK-104治疗组可明显诱导HepG 2的细胞凋亡,出现相当比例的DNA含量小于二倍体的亚G1凋亡峰(24%),不同周期细胞的比例也发生变化,与MEV共同作用后可消除NK-104的这种诱导作用。见图3。

  2.4 NK-104对caspase-3活性的影响 与对照组相比,NK-104可明显诱导caspase-3活性( P < 0.01 ),同样加入MEV能够消除NK-104的这种诱导作用。见图4。

  图2 NK-104处理48 h后HepG 2细胞核的形态变化(Hoechst33258染色, ×400)(略)

  Figure 2 Nuclear morphology of the HepG 2 cells treated by NK-104 for 48 hours (Hoeschst 33258 staining, ×400)

  A: Control, normal nuclear structure; B: NK-104 10 μmol/L; C: NK-104 100 μmol/L; ●: Cytoplasmic change; ■: Nuclear fragmentation.

  图3 NK-104治疗HepG 2细胞后细胞周期分布变化(略)

  Figure 3 Cell cycle analysis of HepG 2 cells treated by NK-104 (Percentage of Sub G1cells)

  **P <0.01, vs control group. A: Control; B: NK-104 10 μmol/L; C: NK-104+MEV.

  图4 NK-104对caspase-3活性的影响(略)

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